伊朗伊斯兰共和国建立后不久，两伊战争爆发。哈梅内伊先后担任伊朗国防部长和伊朗伊斯兰革命卫队总司令。由于拥有杰出的辩论和演讲才能，他一度被任命为德黑兰的聚礼领拜人。

1981年是哈梅内伊人生中至关重要的一年。当年6月，当他在位于德黑兰南部的阿布扎尔清真寺发表演讲时，一个事先装有炸弹的录音机在他面前爆炸。爆炸导致他的手臂、声带和肺部受到严重伤害，并且就此失去了右臂的使用能力。10月，在伊朗时任总统拉贾伊遇刺后，哈梅内伊以绝对优势当选总统，成为伊朗首位教法学家总统。

哈梅内伊的总统任期绝大部分处于两伊战争时期。在此期间，他经常亲临前线，赢得了伊朗军队和革命卫队的忠诚。他在领导伊朗对抗伊拉克萨达姆政权入侵的同时，致力于伊斯兰革命卫队的建设。有分析指出，伊朗在两伊战争期间陷入孤立的历史事实，加深了哈梅内伊对于西方国家的不信任，深刻地影响了他后来的政治理念。

约翰斯·霍普金斯大学人类学和中东研究副教授纳尔吉斯·巴约格利指出：“他是在两伊战争中成长起来的领导人，这场战争塑造了他对国内外政治的看法。一旦他成为最高领袖，他就专注于建立一支能够抵御围困、持续抵抗的军事力量。”

1989年，伊朗伊斯兰共和国首任最高领袖霍梅尼去世。在去世前一年，霍梅尼选择将长期被视为伊朗二号人物以及霍梅尼接班人的蒙塔泽里边缘化，转而指定哈梅内伊为最高领袖。然而，哈梅内伊的最高领袖资格一度遭到了质疑。根据霍梅尼时期的伊朗伊斯兰共和国宪法，伊朗最高领袖必须由伊斯兰教什叶派的“效仿源泉”和拥有阿亚图拉头衔的教法学家担任，而哈梅内伊当时仅拥有“霍贾特伊斯兰”的中高级教士头衔。为了确保哈梅内伊顺利继任最高领袖，伊朗最终修改宪法，放宽了担任最高领袖的宗教资格要求。