B-2轰炸机第一次投入实战是在塞尔维亚的科索沃战争,这是投入服役十年后的第一次出战。当地时间1999年5月7日夜间,北京时间1999年5月8日,首次投入实战的B-2轰炸机使用三枚精确制导炸弹直接击中了中华人民共和国驻贝尔格莱德大使馆,当场炸死来自新华社的邵云环、《光明日报》的许杏虎和朱颖三名中国记者,炸伤数十人,造成大使馆建筑的严重损毁。其中一枚JDAM未当场爆炸,直到五年后才由塞尔维亚方面取出销毁。之后中国方面认为这是一次蓄意的轰炸,可能是对中国此前反对北约轰炸南联盟的报复,因此向美国提出强烈的抗议,北约解释这是误炸。
2003年3月,B-2投入伊拉克战场,一架B-2在28日晚上首次实战投放了两颗2130千克的新型EGBU-28制导炸弹,炸毁了巴格达市内位于底格里斯河畔的一个通讯塔。这是美军在伊拉克战争中使用的最大的炸弹。
2008年2月23日,一架编号89-0127(命名为堪萨斯幽灵号)在美军关岛安德森空军基地起飞时坠毁,机上两名飞行员平安获救。调查显示B-2轰炸机在起飞前,24个传感器之中的三个传感器被水汽损伤,测得错误的大气资讯,导致飞控电脑错误计算起飞所需的飞行速度和上升角度。尽管机上两名飞行员试图修改错误资讯,但并不成功,飞机随即冲向地面爆炸起火。
2010年2月,B-2轰炸机(编号:88-0332)华盛顿幽灵号在关岛安德森空军基地地面启动时四台发动机中的一台发生火灾,同时损坏了发动机舱和其他部件。这架B-2于2014年1月9日修复完成重新入役。
2013年3月28日,美国空军派出两架B-2隐形轰炸机前往韩国参加韩美联合军演“秃鹫”。这是美国首次派遣可携带核武器的B-2隐形轰炸机赴朝鲜半岛进行实弹演习。
当地时间2018年10月23日早上,美国空军一架B-2隐形轰炸机在飞行途中遇紧急情况,在科罗拉多泉机场迫降。